reparation and Characterization of Phyto-Copper Nanoparticles Using Phragmites australis and Evaluation of Their Biological and Veterinary Applications

Abstract

الملخص: تهدف هذه الدراسة إلى تقييم عملية تخليق وتوصيف الأنشطة البيولوجية - بما في ذلك الخصائص المضادة للأكسدة، والمضادة للالتهابات والمضادة للبكتيريا، والمضادة للأورام الجسيمات النحاس النانوية (CuNPs) التي تم تخليقها بيولوجيا باستخدام مستخلصات مائية من أوراق وجذامير نبات القصب بالإضافة إلى ذلك، تقيم الدراسة السلامة والتسمم والتأثير المحتمل للتلقيح البيولوجي لهذه الجسيمات النانوية في نموذج دجاج التسمين، مع التركيز على أداء النمو، ومعدل البقاء على قيد الحياة، والعلامات الحيوية الفسيولوجية . خضعت المستخلصات النباتية لتحليل كيميائي نباتي كمي ونوعي قبل استعمالها في تصنيع الجسيمات النانوية. هذه الأخيرة تم توصيفها باستخدام تقنيات تحليلية مختلفة للتأكد من حجمها وشكلها واستقرارها، مثل مطيافية الاشعة المرئية وفوق البنفسجية والمجهر الالكتروني الماسح والنافذ والاشعة السينية الخاصة بالبلورات ومطيافية الاشعة تحت الحمراء وقياس جهد زيتا. كما تم اجراء تقييمات مختبرية لمعرفة الخصائص المضادة للأكسدة والمضادة للالتهابات لكل من المستخلصات النباتية والجسيمات النانوية باستخدام البروتوكولات المتعارف عليها. هذا واظهرت جزيئات النحاس النانوية نشاطا مضادا للبكتريا ملحوظا وذلك باستخدام طريقة انتشار القرص على كل من البكتيريا موجبة وسالبة الغرام. كما تم تقييم النشاط المضاد للأورام للجسيمات النانوية باستخدام اختبار MTT . بعد الدراسات المختبرية، أجريت التجارب في الجسم الحي على مرحلتين: الأولى تهدف إلى تقييم السمية لجسيمات النانو على 15 دجاجة من دجاج التسمين مقسمة إلى 5 مجموعات 3 في كل منها مجموعة ضابطة ومجموعة حقنت في العضلة بـ 25 مع كغ وزن الجسم بجسيمات ثانوية صنعت بأوراق القصب واخرى بنفس الجرعة من جسيمات نانوية صنعت بجذامير القصب في حين قيمت المرحلة الثانية التأثير الدوائي للجسيمات النانوية على 100 كتكوت دجاج التسمين بعمر يوم واحد تم تقسيمها عشوائيا إلى خمس مجموعات (ن (20) المجموعة الأولى تم حقنها في عضلة الصدر، في اليوم الرابع، ب 5 مع كغ من الجسيمات النانوية النحاسية الورقية ، والمجموعة الثانية ب 5 مع كغ من الجسيمات النانوية النحاسية الجذمورية ، والمجموعة الثالثة بمزيج من كلتا الجسيمات النانوية النحاسية | الجسيمات النانوية النحاسية الورقية والجذمورية، والمجموعة الرابعة تركت بدون أي حقن، أما المجموعة الخامسة فقد تلقت التطعيم والدواء المعتمد عليه في مزارع التسمين. وأعيد حقن المجموعات الثلاث الأولى بعد 10 أيام بنفس الجرعة من الجسيمات النانوية النحاسية النباتية الأصل، وبعد 10 أيام بجرعة مضاعفة تمت التضحية بأربعة دجاجات من كل مجموعة بعد 4 أيام من الحقن الأخير وتم تقييم مختلف معايير تحليل الدم والكيمياء الحيوية والإجهاد التأكسدي في كلتا مرحلتي الدراسة. كما تمت الدراسة التشريحية للكبد أيضا. أظهرت نتائج التحليل الكيميائي النباتي للمستخلصات النباتية ثراءها بالمركبات النشطة المختلفة: الفينولاتوالفلافونويداتوالتربينويدات التي قد تفسر النشاط المهم المضاد للالتهابات الذي تم الكشف عنه وفقا لنتائج فحص انحلال الدم، وفيما يتعلق بتوصيف جسيمات النحاس النانوية المصنوعة من مستخلصات نبات القصب أشارت أطياف الامتصاص بالأشعة فوق البنفسجية والمرئية إلى قمم بارزة عند 312 نانومتر و 300 نانومتر للجسيمات النانوية النحاسيةالمصنوعة من الأوراق والجذامير على التوالي. تم إثبات التركيب البلوري لجسيمات النحاس النانوية المصنعة نباتيا من خلال تحليل حيود الأشعة السينية (XRD)، وكشف عن حجم حبيبات يقدر ب 18.06 نانومتر للجسيمات المستمدة من الأوراق و 18.24 نانومتر لنظيراتها المستمدة من الجذامير وعلاوة على ذلك، تم حساب متوسط قطر جسيمات النحاس النانوية ليكون 13.22 نانومترا لتلك المشتقة من الأوراق و 19.76 نانومترا لتلك المشتقة من الجذامير. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت الجسيمات النانوية المصنعة خصائص كبيرة مضادة للأكسدة، كما يتضح من قيم ICso التي بلغت 4.62 ميكروغرام مل و 78.99 ميكروغرام مل في اختبارات DPPH و FRAP على التوالي لجسيمات النحاس الثانوي المشتق من الأوراق. أما قيم ICso المرتبطة بالنشاط المضاد للالتهابات فكانت مهمة مما يؤكد الإمكانات الكبيرة لجسيمات النحاس الثانوي على مكافحة الالتهاب. أظهرت التأثيرات السامة للجسيمات النانوية النحاسية على الخلايا السرطانية 7-MCF فعالية تعتمد على الجرعة عند تركيزات ضئيلة: 3.53 ميكروغرام / مليلتر بالنسبة للجسيمات النحاسية المشتقة من الأوراق و 2.28 ميكروغرام / مليلتر بالنسبة لتلك المشتقة من الجذامير وعلاوة على ذلك، أظهرت نتائج السمية الحادة بعض التغيرات في علامات الكيمياء الحيوية والدموية والإجهاد التأكسدي دون حدوث موت الحيوانات من ناحية أخرى تشير نتائج المرحلة الثانية من الدراسة في الجسم الحي إلى أن حقن الجسيمات النحاسية النانوية المصنوعة بمستخلصات نبات القصب كتلقيح بيولوجي لم تحدث أي آثار سلبية على نمو كتاكيت التسمين فقد كان معدل الوفيات في المجموعة المعالجة حوالي 8% مقارنة بأكثر من 50% في المجموعة غير المعالجة، مما يشير إلى دور هذه الجسيمات النانوية في تحسين معدلات البقاء على قيد الحياة . أما بالنسبة للوزن النهائي عند نهاية فترة التربية، فقد كان وزن الدجاج في المجموعة التي تلقت العلاج النانوي مماثلا للمجموعة التي خضعت للعلاج التقليدي. والأهم من ذلك، أن المجموعة التي تلقت مزيجا من الجسيمات الثانوية تجاوزت وزن المجموعة التقليدية، حيث بلغ متوسط وزنها 3.2 كجم، مقارنة بـ 3.09 كجم في المجموعة التي تلقت العلاج التقليدي. هذه النتائج تؤكد أن استخدام الجسيمات النانوية، خاصة عند دمجها كمزيج، قد يكون له تأثير إيجابي على النمو وزيادة وزن الدجاج اللاحم. تشير هذه الدراسة إلى المزايا القيمة الجسيمات النحاس النانوية (CuNPs) كمنتج غير ضار وفعال وغير مكلف في تربية دجاج التسمين، غير أنه من الضروري إجراء المزيد من البحوث الإضافية لدراسة الآليات الأساسية لعملها والنتائج طويلة الأمد لدمج جسيمات النحاس النانوية في تربية دجاج التسمين، لتحسين نتائج الإنتاج وتعزيز أداء الطيور

Abstract: This study aims to evaluate the synthesis, characterization, and biological activities— including antioxidant, anti-inflammatory, antibacterial, and antitumor properties—of copper nanoparticles (CuNPs) biosynthesized using aqueous extracts from the leaves and rhizomes of Phragmitesaustralis. Furthermore, the study assesses the in vivo safety, toxicity, and potential biovaccination effect of these CuNPs in a broiler chicken model, with a focus on growth performance, survival rate, and physiological biomarkers. The plant extracts have previously undergone both quantitative and qualitative phytochemical analysis. To confirm their size, shape, and stability CuNPs were characterized using various analytical techniques, such as UV-Vis spectroscopy, FTIR, SEM, TEM, XRD, and Zeta potential. In vitro assessments were conducted to evaluate the antioxidant and anti-inflammatory properties of both plant extracts and plant-based NPs using standard protocols. The investigation of antibacterial efficacy was performed on both Gram-positive and Gram-negative bacterial strains utilizing the disk diffusion method, wherein the copper nanoparticles synthesized from P. australis exhibited intermediate effectiveness. The anti-tumor activity of the plant-based CuNPs was assessed using the MTT assay. Following the in vitro studies, in vivo experiments were performed in two phases: the first aimed to determine the acute toxicity of the NPs on 15 broiler chickens (Arbor Acres) divided into 5 groups 3 in each: control, 25 mg/Kg BW (Leaf-based CuNPs), 25 mg/Kg BW (Rhizome-based CuNPs), 50 mg/Kg BW (Leaf-based CuNPs), and 50 mg/Kg BW (Rhizome-based CuNPs), while the second phase evaluated the biovaccination effect of the NPs on 100 one-day-old broiler chicks that were randomly divided into five groups (n=20). The first group was injected into the breast muscle, on day 4, with 5mg/Kg BW of leaf-based CuNPs, the second group with 5mg/Kg BW of rhizomebased CuNPs,thethirdgroupwithamixtureofbothsynthesizedCuNPs(Leafandrhizome-basedCuNPs),thefourth Groupwasleftwithoutanyinjectionandthefifthgroupreceivedthestandardvaccinationandmedication.

The three first groups were re-injected after 10 days with the samedose of the plant-based CuNPs, and after 10 days with a double dose. Four birds from each groupwere sacrificed 4 days after the last injection. Various hematological, biochemical, and oxidativestress parameters were assessed in both study phases. Liver histology was studied as well. Resultsof the phytochemical analysis of the plant extracts demonstrate their richness of different activecompounds: phenols, flavonoids, and terpenoids which may explain the important anti-inflammatory activity revealed according to hemolysis assay results. Regarding thecharacterization of P. australis-based Cu NPs, the UV-Vis absorption spectra indicated prominentpeaks at 312 nm and 300 nm for copper nanoparticles derived from leaf and rhizome sources,respectively. The crystalline structure of the phyto-synthesized Cu NPs was substantiated throughX-ray diffraction (XRD) analysis, revealing an estimated grain size of 18.06 nm for leaf-based CuNPs and 18.24 nm for rhizome-based counterparts. Furthermore, the average diameter of Cu NPswas calculated to be 13.22 nm for those derived from leaf sources and 19.76 nm for thoseoriginating from rhizome sources. Additionally, the synthesized nanoparticles demonstrated significant antioxidant properties, as evidenced by IC50values of 4.62 µg/ml and 78.99 µg/ml in DPPH and FRAP assays, respectively, for leaf-derived Cu NPs. The IC50values associated withanti-inflammatory activity in both assessments were notably pronounced, underscoring theconsiderable potential of green-synthesized Cu NPs. The cytotoxic effects of PhragmitesaustralismediatedCu NPs against MCF-7 cell lines exhibited a dose-dependent response at minimal concentrations: 3.53 µg/ml for leaf-derived Cu NPs and 2.28 µg/ml for those derived from rhizomes. Moreover, the acute toxicity findings show some changes in biochemical, hematological, and oxidative stress markers without signaling death. On the other hand, the outcomes of the second phase of the in vivo study indicate that the injections of Phragmites australis-based Cu NPs had no detrimental impact on the growth and survival of broiler chicks. Their weight gain and overall performance remained comparable to those of chickens that received vaccination, medication, and supplemental nutrition. Notably, the mortality rate in the biovaccinated groups was approximately 8%, whereas it exceeded 50% in the untreated group. This suggests that these nanoparticles may not only support healthy development but also significantly enhance survival rates in broiler chickens. Regarding the final weight at the end of the rearing period, the chickens in the group that received the green nanoparticles treatment exhibited a weight comparable to those in the conventional treatment group. More notably, the group that received a mixture of P. australis-based copper nanoparticles surpassed the weight of the conventional group, reaching an average of 3,2 kg, compared to 3,09 kg in the conventionally treated group. These findings highlight the potential of P. australis-based copper nanoparticles treatments, especially when combined, to positively influence growth and weight gain in broiler chickens. This study points out the valuable advantages of copper nanoparticles (Cu NPs) as a harmless, cost-effective, and efficient product in broiler chicken farming. Additional research is imperative to examine the fundamental mechanisms and long-term consequences of integrating Cu NPs into broiler farming, to optimize production outcomes and enhance the performance of the birds.